Enzimatik Immunoassay ELISA


Immunoassay enzimë (ELISA) - Hulumtimet bashkëkohore laboratorike në të cilat antitrupat e kontrolluar specifike apo antigjene në gjak të sëmundjeve të veçanta për të identifikuar jo vetëm etiologjinë, por edhe në fazën e sëmundjes. Rezultatet ELISA mund të duket cilësore dhe sasiore.

Në ditët e sotme ELISA është përdorur në situatat e mëposhtme:

1) Kërko për antitrupave specifike për ndonjë sëmundje ngjitëse;
2) antigjenët kërkoni ndonjë sëmundje veneriane (infektive);
3) të studiuar statusin hormonal të pacientit;


4) testimi për shënuesve tumor;
5) ekzaminimin për praninë e sëmundjeve autoimune.

Përfitimet metodën ELISA:

1) Specifiteti i lartë dhe ndjeshmëri e ELISA (mbi 90%).
2) Aftësia për të përcaktuar dhe ndjekur dinamikën e procesit të sëmundjes, dmth krahasuar numrin e antitrupave në intervale të ndryshme kohore.
3) Disponueshmëria e ELISA diagnostike në çdo strukturë mjekësore.

Mungesa relative:

1) Zbulimi i përgjigjes imune (antitrupat), por jo të patogjen.

Konceptet themelore

Para se të sqaruar thelbin e metodës së ELISA, shkurtimisht të kuptuar disa koncepte.

Antitrupat (ose imunoglobulinat - IG) - Proteinat specifike të prodhuara nga B -
limfocitet (qeliza imunitare) në përgjigje të një hit në trupin e një patogjenëve infektive (viruset, bakteret, kërpudhat, etj). Ka imunoglobulina A (IgA), imunoglobulinave E (IgE), imunoglobulina M (IgM), imunoglobulina G (IgG), imunoglobulina D (IgD). Ato ndryshojnë nga njëri-tjetri dhe të formojnë në masë molekulare, gjysmë-jetës, pjesëmarrje / jo pjesëmarrjen në procesin infektive, kohën zbulimin pas infektimit. Nëse marrim parasysh peshën molekulare, më ai IGM - ajo pentamerin (950 000 Daltone) ndryshe Ig tjetër (150-200 000 Po), kështu që IgM thjesht nuk mund të kalojë pengesën placentar. Prandaj, zbulimin e IgM në një fëmijë 1 vit e jetës është gjithmonë një shenjë e infeksionit në fetus. Imunoglobulinat serum përfaqësuar pjesën më të madhe të saj IgG (75-85%), dhe më e ulëta - IgE (0003%). Në procesin infektiv vetëm të marrë një pjesë të drejtpërdrejtë IgA, M, G. IgE është një shenjë e reaksioneve alergjike dhe sëmundjet, dhe IgD - mund të gjenden vetëm në nyjet limfatike dhe bajamet indeve, luan një rol të rëndësishëm në formimin e imunitetit lokale.

Klasa e imunoglobulinave

Antigjenet - Substanca macromolecular me origjinë organike, duke përfshirë sëmundjet infektive dhe të tjera, si dhe substanca të ndryshme ndryshuar qelizave të formuara nga një ose një tjetër sëmundje (sëmundje autoimune, onkologjisë).

Kompleksi imun - Kompleks antigen-antitrup që është e përfshirë në procesin imunitar.

Çfarë metodë ELISA bazuar.

Ka disa varieteteve të ELISA (direkt metodë, indirekt të bllokuar, konkurruese), por në praktikë shpesh përdoret faza të ngurta analizë heterogjene imunitar ose ELISA (enzimë lidhur shqyrtim immunosorbent)

Baza ELISA reagim imun është një antigen dhe antitrupa të formuar kompleksin imun: antigen-antitrup, që rezulton në një ndryshim në aktivitetit enzimatik të etiketa specifike në sipërfaqen e antitrupave.

Metoda IFA

Në terma të thjeshtë, ky proces mund të ndahet në disa faza:

1) Mjeku vrima sipërfaqësore tabletë pedagog është pastruar antigjen patogjen specifik. Duke shtuar material biologjik (serum të gjakut) është reaksion pacient specifik midis antigjeni dhe antitrupi dëshiruar (imunoglobulinës). Kjo lidhje do të veprojë si "një antigjenit të veçantë" në fazën e mëposhtme.

2) Në këtë fazë është formimi i IR (komplekset imune) - reaksion midis "antigjenit specifik" dhe çift (ajo imunoglobulinave etiketuar me peroxidase enzimë). Chromogen veçantë është shtuar. Rezultati i këtij reagimi enzimatik është formimi i substancave me ngjyra në vrimën e tabletë, intensiteti i ngjyrës varet nga shuma e përmbajtur në materialin e imunoglobulinave pacientit (antitrupat).

3) Pastaj, rezultati i përgjithshëm: fotometryrovanye përdorur një spectrophotometer multichannel, krahasuar densitetin optik e testit materiale testet e kontrollit të densitetit optik, rezultatet përpunimit matematikore. Numri i antitrupave në pacient varet lartësinë e densitetit optik e puseve.

Zakonisht në praktikë, duke përdorur 96 dhe pllaka.

Kur matjen densiteti optik (OP) numëron numrin e lëngshme testit (ose përqendrim) të antitrupit për një vëllim të caktuar njesi. Rezultatet janë pastaj krahasuar me një mostër e kontrollit.

Ajo duhet të mbahet mend:për çdo sistem provë zhvilluar tregues të veçanta për rezultatet e kontabilitetit, normat e performancës dhe patologji (dmth "vlerës referencë"). Kjo duhet të merren parasysh kur vlerësimin e rezultateve të çdo studimi individual. Gabimisht interpretojnë rezultatet e një laboratori i vetëm në "vlerat e referencës" një tjetër laborator. Gjithashtu i gabuar për të krahasuar rezultatet e laboratorëve të ndryshme me njëri-tjetrin.

Kur vendosjen reagime ELISA dhe koncepte të rëndësishme të tilla si lakmi e antitrupave.
Antitrupat lakmi - Kjo është forca e lidhjes me antigjenin dhe antitrupave dhe sasinë e antigjenit që është në lidhje me immnohlobulinami (antitrupat). Lakmi është i rëndësishëm në vlerësimin e kohës parashikuar e infeksionit që është jashtëzakonisht i rëndësishëm në diagnozën e infeksionit primar në gratë shtatzëna.

Baza e testit lakmi antitrupave konsiston në përpunimin e komplekse zgjidhje imunitar (antigjen-antitrupave) e ure për të shkatërruar proteina. Lidhja Vysokoavidni të mbetet e paprekur dhe nyzkoavidnyh shkatërruar. Rezultati është dhënë në formën e indeksit lakmi, shprehur si përqindje (%).

Cilat sëmundje janë zbuluar nga ELISA diagnostifikim?

1. Infeksionet
1.1 Viral hepatitis A (IgM, G), B antigjenët -HBsAg, pacientët HBeAg, antitrupave IgM - HBcorAg, Ig totale HBcorAg, IgG pacientët HBeAg), C (antitrupa Ig M, G HCV), D (IgM, G), E (GN M, G) dhe të tjerë.
1.2 Infeksioni HIV (IgG)
1.3 Tsytomehalovyrusnaya infeksionit (antitrupat IgM, G)
1.4 Epstein-Barr virus infeksion ose mononkleoz (antitrupave IgM, G EA, VCA, proteinat NA të virusit)
1.5 infeksionit herpetike (antitrupat IgM, G)
1.6 toxoplasmosis (antitrupave IgM, G)
1.7 Rubeola (IgM, G)

1.8 Fruthi (IgM, G), bruceloza (IgM, G), pseudotuberculosis (IgM, G), salmonellezom (IgM, G), Shyhellez apo dizenteri (IgM, G), aspergillosis (IgM, G), Tick-përballohen encefalit dhe Borreliosis shumë të tjerë.
1.9 Parazitoza (giardiasis, toxocarosis, trikinoz, opisthorchiasis, echinococcosis, alveokokkoz dhe të tjerët) në të cilën IgG zbuluar
1.10 STD (sëmundje seksualisht të transmetueshme) - mycoplasmosis (IgM, G), ureaplasmosis (IgM, G), Klamidia (IgA, M, G), sifilizi (IgG)
1.11 infeksion Pylori (IgG)

2. shënuesve të sëmundjeve autoimune dhe parametrat imunitar të njeriut (IgE totale, total IgG, IgA totale, total IgM, i përgjithshëm IgD, IgA sekretore, IgG 2, lgG4, KQZ-qarkullojnë komplekset imune, IgA dhe IgG për gliadin, etj)

3. shënuesit Onkolohichsekie (TNF - faktorin tumor nekrotizues, CEA - antigjenike carcinoembryonic, PSA - hCG prostatspetsyfichnyy antigjen - Gonadotropin chorionic njerëzore, CA 125, alveomutsin dhe shumë të tjerë)

4. Çrregullime riprodhuese (estradiol, progesterone, Hormoni, testosterone, alfafetoproteyn AFP-, FSH - gjëndër-stimuluese hormone dhe të tjerët)

5. tiroide (T3 e lirë dhe të lidhur, T4, thyroglobulin, tireoperoksidaze - TPO, tiroide-stimuluese hormon - TSH).

Kjo listë është paraqitur jo të gjitha sëmundjet janë diagnostikuar duke përdorur ELISA.

Materiale për analiza dhe rregullat e gardhit ELISA

Materiali më i zakonshëm për reagimet ELISA - serumin e pacientit të gjakut, të marra në një stomak bosh. Materiali mund të shërbejë gjithashtu si lëngut cerebrospinal, lëngut amniotik, përmbajtjen tejdukshëm, mukozë mitrës dhe swabs uretrës.

Përgatitja e pacientëve për dërgimin e materialit për ELISA

Gjaku është marrë në një stomak bosh. Para çdo gjak nuk ka nevojë për të marrë ndonjë drogë. Trajtim specifik (antibacterial, antivirale, protyvoparazytarnoe etj) duhet të ndalojë të paktën 2 javë para studimit.

Kushtet prodhimit IFA

Materiali enzimatik Immunoassay është i shpejtë, brenda natës. Vonesat mund të jetë në laboratorë të ndryshëm për shkak të akumulimit të një numri të Sera.

Rezultatet e mundshme të ELISA diagnostifikimit

Në vlerësimin e rezultateve në infeksione specifike Antitruptha klasit të rëndësishme dhe numri i tyre. Në këtë varet jo vetëm etiologjinë e infeksionit (ose jo duhet), por edhe faza e parashikueshme e sëmundjes (akute, kronike), dhe prania e infeksionit aktive (akut ose rëndim të kronike) në kohën e anketës.

Cilat janë koha e përafërt e shfaqjes e antitrupave (imunoglobulinave - IG)?

Antitrupat hershme janë IgM. Identifikoni ato mund të jenë 1-3 javë pas infektimit të mundshëm, që karakterizojnë fazën akute të infeksionit. Situata e dytë është paraqitja e antitrupave IgM - aktivizimi (ose përkeqësim) i procesit kronike. Kundërtrupat IgM qarkullojë një mesatare prej rreth 3 muaj, atëherë numri i tyre gradualisht zhduket. Megjithatë, në disa pacientë, shumat gjurmë të IgM mund të ndodhë brenda viteve 1-2h të infeksionit.

Sistemet moderne të testimit me ndjeshmëri të lartë, duke rezultuar në rezultate të rreme-pozitive janë jo-specifike (shpesh në gratë shtatzëna). Prandaj, në këtë grup të pacientëve IgM pozitiv duhet të testohen!

Antitrupat IgA shfaqen 2-4 javë pas infeksionit, por në një shumë të mjaftueshme për të identifikuar - në një muaj. IgA në serum sintetizohet nga qelizat plazma e shpretkës, nyjet limfatike dhe mukozës, IgA sekretore përqendruara në mukozës për të kryer funksionin e tij mbrojtëse - pjesëmarrja në imunitetin lokal.

Nga java e 4 pas infeksionit fillojnë të shfaqen antitrupa IgG. Në shumicën e infeksioneve titri rritur gradualisht nga një maksimum në kohë të ndryshme (mesatarisht 1.5-2 muaj), pastaj titre mbetet në nivel të ulët dhe pikë për sistemin imunitar. Në disa sëmundje (mycoplasmosis, klamidia, trichomoniasis) niveli i IgG nuk është i lartë, ul në mënyrë të konsiderueshme për shkak të mungesës së imunitetit në këto infeksione.

Opsionet për zbulimin e antitrupave e klasave të ndryshme:

- Izoluar zbuluar kundërtrupat IgM supozon se primare

infeksion.
- Zbulimin e njëkohshme e IgM dhe IgG gjaku tipike për infeksion primar
në 2-3 muajve, si edhe acarimit e semundjes kronike. Kështu, prania e IgM në shtatzëni nuk është gjithmonë një shenjë e infeksionit primar.
- Identifikimi i izoluar IgG mund të tregojë se si imunitet ndaj sëmundjes,
dhe infeksion kronik. Në situatën e dytë është e rëndësishme dhe numri i antitrupave (titrit) dhe ndryshimit të dinamikës titrit. Në mënyrë tipike, studimet kryer në intervale prej 2-4-6 javë.

- Zbulimi i IgA ose IgM izolimi tregojnë infeksion primar. Në
paraqitja e IgA me IgG pritet aktivizimin e infeksionit kronik (mesatarisht 2 javë nga data e përkeqësimit).

Përcaktimi i lakmi antitrupave IgG është një diagnozë e shkëlqyer plotësuese fazë e infeksionit primar nga infeksioni i vjetër që ka rëndësinë e saj klinike, veçanërisht në vlerësimin e rrezikut të infeksionit intrauterine të fetusit. Zbulimi i IgG nyzkoavidnyh tregon infeksionit primar dhe janë një mesatare prej 4-6 muaj pas infeksionit, rrallë gjatë. Nyzkoavidnyh IgG kërkojnë prova të tjera laboratorike të infeksionit primar (IgM). Antitrupave Vysokoavidni është ose një shenjë e sëmundjeve kronike dhe rëndim të saj, apo imuniteti formuar.

Features në foshnjat:Fëmijët deri në një vit dhe nganjëherë 1.5 vjet në gjakun e nënës qarkullojnë IgG ndaj infeksioneve (që ishte depërtimi i tyre nëpër placentë nga nëna tek fetusi në utero). Kjo nuk është në vetvete një shenjë e pranishëm infeksionit. Nëse mosha takjm janë IgM (kujtojmë se nënës IgM depërtojnë placentën nuk mund të), atëherë kjo është një shenjë e infeksionit të fetusit apo infeksion fituar pas lindjes.

Metoda sasiore ELISA

Rezultati i diagnostifikimit ELISA (duke përdorur ELISA Analyzer) shfaqet në njësi të caktuara:
- Dendësia optik (OP) mostër - përqendrimi i antitrupave specifike në volumin e njësisë. Mostrat larta OP, i lartë përqendrimi i antitrupave. Disa rezultate referohet raportin e positivity (CP) - kjo është edhe dendësia optik i mostrës.
- Njësitë e përqendrimit të antitrupave (nanohramm / milliliter, ose ng / ml).
- Në një serum titri: 01:20, 01:40, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1: 1200, etj. Titri diagnostike (në të cilën sëmundja është diagnostikuar, dhe jo fakti i infektimit) për sëmundje të ndryshme janë të ndryshme.

- Në formën e simbolet - "+", "-", (+, ++, +++, ++++)? "".
- Në një vlerësim cilësor të një kriteri të caktuar (pozitiv apo negativ).

Korrekt vlerësojnë sasinë e zbulimin e antitrupave të klasës IgG opsion dhe, për këtë arsye, të përgatisë terrenin e sëmundjes dhe kanë nevojë për trajtim të vetëm mund mjek.

Ne nuk duhet të harrojmë se për çdo sistem provë të zhvilluar nga "vlerat reference" e tyre (rregullat variant), mbi të cilat dhe diagnostikuar një sëmundje të caktuar (opsionet patologji). Për sisteme të ndryshme të testit "vlerave referuese" janë të ndryshme.

Correct krahasuar rezultatet e IFA, të marra në dinamikën, është e mundur vetëm në rast të prodhimit në të njëjtin laborator.